Hablando de virus... (Capitulo 5. Identificando al enemigo)

Antes de empezar quiero aclarar que no tengo ninguna intención de meterme en corral ajeno. Ni soy ni quiero ser ningún experto en estos temas de análisis fitopatológicos –sin duda aburridos para un profesional del campo, aunque sea tan friki como yo–, y desde luego no creo que sean de mucho interés para los visitantes asiduos del blog. Pero tanto me ha preguntando cierto lector anónimo que no he tenido más remedio que satisfacerlo –a fin de cuentas presumo de ser hombre de palabra–. En fin, ya que me pongo espero que haya algún valiente que llegue al final del post...
Como sabe cualquiera que haya sufrido tratando de sacar un cultivo adelante, la fitopatología se parece mucho a una guerra y –como en cualquier guerra– lo primero y principal es identificar al enemigo; y cuando se trata de patógenos vegetales esto no siempre es fácil… Con los insectos y ácaros es menos complicado; los ves a simple vista y –metiéndolos debajo de un binocular– puedes observar su anatomía y distinguir –más o menos– a unos de otros. Con los hongos es bastante más difícil, pero al menos ves sus estructuras y en muchos casos –está vez con ayuda del microscopio óptico– pueden distinguirse las distintas especies por sutiles diferencias morfológicas. Con el resto de los patógenos y especialmente con los virus la cosa se complica; para verlos en detalle hacen falta microscopios electrónicos, pero –aunque se han desarrollado técnicas para detectar con ellos algunos virus vegetales (ver aquí)– las técnicas son complejas y esos cacharros son bastante caros y difíciles de manejar, así que en la práctica sólo se utilizan en investigación. Evidentemente, podemos basar nuestro diagnóstico sólo en los síntomas observables de la enfermedad, pero a menudo los síntomas son confusos y pueden llevarnos a errores… Vamos, que para identificar inequívocamente a un virus no hay más remedio que recurrir a pruebas biológicas o analíticas; y al desarrollo y puesta a punto de esas pruebas se han dedicado desde hace bastantes décadas unos imprescindibles aliados nuestros: los fitopatólogos. En mi opinión la victoria en muchas “batallas fitopatológicas” –pasadas, actuales y por venir– depende y dependerá de la sinergia entre agricultores, técnicos de campo y fitopatólogos. Al fin y al cabo, nuestra experiencia de campo no sirve de nada sin sus conocimientos; y viceversa.
Centrándonos en los virus, en principio sería posible detectarlos e identificarlos combinando distintas pruebas biológicas. Bastaría con infectar en laboratorio determinadas plantas indicadoras que reaccionan mostrando síntomas evidentes y distintivos a determinados virus (ensayo de rango de hospedantes) Además, como ciertos virus se trasmiten sólo si son inoculados por un determinado insecto vector de forma muy específica, se podría identificar un virus en función de que insecto es capaz de trasmitirlo (ensayo de trasmisividad) También podemos probar a infectar plantas indicadoras con nuestro virus desconocido, pero sometiéndolo antes a distintos procesos que reducen la capacidad infectiva –dilución, desecación, choque térmico,…– (ensayo de propiedades in vitro) Pero claro, para analizar muchas muestras tendríamos que cultivar una gran cantidad de diversas plantas indicadoras y criar poblaciones de los principales vectores en condiciones de absoluta asepsia, lo que resulta muy caro y engorroso. Cuando se trata de dar un diagnóstico rápido, económico y preciso –que es lo que necesitamos en el campo– no hay más remedio que recurrir a técnicas analíticas. Y como un virus es “sólo” una –o unas pocas– hebra de ácido nucleico rodeada de una cápside proteica, para analizarlo sólo podemos buscar dos cosas: las proteínas de la cápside específicas o el ácido nucleico específico de cada virus. Y he subrayado el término “específico” para dejar claro que –por ahora– no puede hacerse un “barrido” de muchos virus a la vez. Antes de comenzar a analizar es necesario realizar un pre-diagnóstico o pueden darse muchos palos de ciego –tengo que aclarar que los fitopatólogos especializados en virus de los laboratorios en los que he analizado muestras son auténticos fenómenos en esto–.

Las técnicas más utilizadas para identificar virus están basadas en la detección de las proteínas de la cápside –específicas para cada virus– mediante lo que se conoce como reacción antígeno-anticuerpo, base de una disciplina científica muy seria conocida como serología. Los anticuerpos son proteínas que fabrica el sistema inmunológico de todos los vertebrados –también el nuestro– cuando detectan substancias extrañas en su organismo –denominadas antígenos– y su función es desactivar a estos antígenos uniéndose a ellos. Literalmente hay millones de anticuerpos distintos, cada uno específico para un antígeno concreto. Las plantas no producen anticuerpos, pero si inyectamos un virus vegetal purificado en un vertebrado actuará como antígeno y el sistema inmune del animal producirá anticuerpos específicos para ese virus, que pueden ser extraídos, purificados, modificados y utilizados para fabricar antisueros, que es lo que en la mayoría de los casos se utiliza en los laboratorios para analizar los virus que afectan a nuestros cultivos. En este principio se basa el famoso ELISA (del inglés Enzime-linked Immunoabsorvent Assay) que es la técnica más utilizada para analizar todo tipo de virus y muchos otros patógenos. Hay diferentes técnicas y la más empleada en agricultura es el doble sándwich de anticuerpos o DAS-ELISA (del inglés Double Antibody Sandwich) que describe la primera imagen (las fotos están tomadas de esta completa presentación en PowerPoint sobre detección de virus, que podéis descargar en vuestro ordenador si pulsáis el hipervínculo) La técnica consiste en cebar el fondo de los pocillos de una placa especial con anticuerpos específicos del virus que se quiere testar, para después aportar un extracto de la muestra vegetal sometida a ensayo. Así, si hay viriones en la muestra quedarán atrapados por los anticuerpos en el fondo del pocillo. A continuación se añade otra vez el anticuerpo, pero esta vez unido a alguna encima (por lo que se denomina anticuerpo conjugado) que a su vez se unirá a los viriones fijados. Por último se añade un sustrato que, al ser trabajado por la enzima del anticuerpo conjugado, cambia de color. Si en la muestra había viriones el pocillo cambiará de color, pero se mantendrá incoloro si la muestra estaba limpia. Midiendo la intensidad del color con un espectrofotómetro se tendrá una idea bastante aproximada de la concentración de viriones que había en la muestra sometida a análisis. Aunque la técnica ELISA es muy fiable y permite analizar al mismo tiempo un gran número de muestras, también tiene sus limitaciones. En primer lugar desarrollar antisueros comerciales sólo tiene sentido cuando hay mucho consumo, así que para virus poco habituales no es fácil encontrarlos. Por otra parte muchos virus vegetales sólo acumulan viriones en el floema y –como a la hora de preparar la muestra es difícil seleccionar las células floemáticas– el extracto aportado tiene pocos viriones y falta sensibilidad, ocasionando falsos negativos. Además el ELISA es incapaz de detectar los viroides, pues estos patógenos carecen de cubierta proteica. En estos casos no queda otra que buscar los ácidos nucleicos.

Cuando no se dispone de antisueros comerciales suelen emplearse técnicas basadas en la hibridación molecular de ácidos nucleicos –globalmente conocidas como NASH (del inglés Nucleic Acid Spot Hibridization)–. En estos ensayos se emplean pequeñas cadenas de ARN o ADN denominadas sondas moleculares (molecular probe) que han sido marcadas con algún compuesto que pueda ser fácilmente detectado con anticuerpos conjugados. Estas sondas moleculares son perfectamente complementarias de un punto específico del ácido nucleico viral, que se denomina diana molecular (molecular target), así que si entran en contacto con una cadena de ácido nucleico del virus para el que han sido diseñadas se unirán a ella formando una cadena doble que quedará así marcada. En la segunda imagen se describe el proceso analítico de una de las técnicas más habituales (aunque el documento es un poco antiguo, hay una descripción de la aplicación de estas técnicas a la detección de virus vegetales aquí) Para hacer el análisis, el ácido nucleico viral se impregna en una membrana de nylon –mediante la aplicación de un extracto de la muestra que se quiere analizar en las condiciones adecuadas– y después se aporta la sonda molecular marcada. Si la muestra fijada en la membrana tiene ácido nucleico viral, la sonda quedará fijada a su diana. Posteriormente se añade un anticuerpo conjugado que se fija a la marca de la sonda molecular y para finalizar un sustrato adecuado para la enzima del anticuerpo conjugado. Si la muestra tenía virus la actividad de la enzima producirá una señal observable (cambios de color o emisión de luz) Estas técnicas de hibridación molecular permiten analizar un gran número de muestras a la vez y son tan o más sensibles que el ELISA, aunque también son más complejas y necesitan diseñar soluciones específicas para cada combinación virus-planta. A pesar de ello parece que la detección de virus vegetales camina en esta dirección y que en el futuro incluso será posible detectar en un solo análisis un gran número de virus. De hecho, actualmente ya existe la tecnología suficiente para construir los llamados chips de ADN (DNA microarrays) –llevan años utilizándose en biología molecular y ya están siendo utilizados en medicina– que posiblemente serán utilizados en el futuro en fitopatología, aunque en la actualidad están en fase experimental. En ellos se colocarían sobre una única superficie muchas sondas de ADN, cada una complementaria de distintos virus vegetales (hablamos de cientos o incluso de miles de virus); y sería el propio ácido nucleico de la muestra el que se marcaría al preparar el extracto. Pero por ahora los análisis “multivirales” no son posibles, aunque a la velocidad que avanzan estas cosas ya veremos cuanto tardan en llegar…

Para los virus vegetales que sólo se localizan en el floema (como es el caso del TYLCV y de los crinivirus) la poca concentración de ácido nucleico viral en los extractos se soluciona fabricando ADN en un tubo de ensayo mediante una técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polimerase Chain Rection) En esta técnica un extracto de la muestra de introduce en un pequeño tubo junto con enzimas ADN-polimerasas, capaces de fabricar ADN a partir de pequeños fragmentos de ADN denominados cebadores (primers) Y precisamente en estos cebadores está el truco, pues se sintetizan de manera que sean perfectamente complementarios a determinadas puntos del ADN viral. El tubo de ensayo se somete a una serie de cambios de temperatura controlados, los cuales inducen la separación de las hebras de ADN, la unión de los cebadores al ADN viral y la fabricación de nuevas cadenas de ADN doble por parte de la ADN polimerasa. Tras repetir este proceso unas 32 veces el fragmento de ADN viral delimitado por los dos cebadores –denominado diana de copia (target copy)– se habrá duplicado unas 1.000 millones de veces –y no, no me he equivocado de número–. Es evidente que, si en el extracto que aportamos inicialmente al tubo había aunque sólo fuera unas pocas hebras de ADN viral, al final de todo este proceso el fragmento de ADN más abundante en la muestra será precisamente la diana de copia. Ahora solo queda separar los distintos fragmentos de ADN según su tamaño aplicando una corriente eléctrica –mediante una técnica llamada electroforesis en gel– y comprobar si la diana de copia está o no presente. En la tercera imagen he tratado de describir gráficamente el proceso, pero reconozco que no es fácil... Aquí podéis descargar una animación flash donde se explica perfectamente la reacción en cadena de la polimerasa (cuando la descarguéis aparecerá un archivo exe en vuestro ordenador que podéis ejecutar sin peligro, no es un virus) En sus comienzos esta técnica resultaba muy engorrosa: las polimerasas se degradaban con las temperaturas altas necesarias para separar las cadenas de ADN –había que añadir nuevas enzimas al inicio de cada ciclo– y además era complicado controlar los ciclos de temperatura. Pero hoy en día se han solucionado esos problemas utilizando ADN-polimerasas de microorganismos extremófilos que viven en aguas hirvientes –las llamadas ADN-polimerasas termoestables– que resisten perfectamente las temperaturas que requiere la separación de las hebras de ADN. Además, el desarrollo de unos aparatos que controlan automáticamente los ciclos de temperaturas –los termocicladores– facilita mucho la aplicación de estas técnicas en cualquier laboratorio. Para los virus con genoma de ARN –que son el 80% de los virus vegetales– se ha desarrollado una técnica muy similar, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa o RT-PCR (del inglés Reverse Transcription PCR) que es exactamente igual que la descrita, pero comienza tratando el extracto de la muestra con una enzima transcriptasa inversa, capaz de hacer copias exactas de ADN a partir del ARN viral. Hoy día, estas mejoras han convertido a la PCR en una técnica habitual en cualquier laboratorio de fitopatología, básica para analizar gran número de virus y otros patógenos.
Pues después de todo este rollo espero que haya quedado claro –para los valientes que haya llegado hasta aquí– que, a pesar de su pequeño tamaño y de no poder verlos, los virus no son enemigos totalmente invisibles. Gracias al trabajo de muchos investigadores hoy en día podemos detectarlos y gracias al trabajo de otros muchos es posible que algún día lleguemos a controlarlos, si es que los políticos nos dejan…
Pero eso lo dejaremos para otro post, porque hoy –como dijo el ex presidente Aznar en el parlamento europeo– “¡Menudo rollazo que he soltao!”…